＜上篇＞己經介紹了一下為什麼要壓寶 Next generation sequencing (NGS) 為明日之星，在開始介紹NGS的應用前，我想要聊一下目前常用的NGS系統，入門的朋友也許可以參考一下，實事上，這反而是最常被問到的問題（敗家議題誰不愛）。不過，我必須先強調一下，我不是這方面的權威，純粹是因為要進行這方面的研究，所以收集了一些資料，把筆記順便跟大家分享，大家請不要把這邊的論述當作評比文，因為我並沒有實驗數據的支持。另外，如果有業界的朋友發現我並沒有真的了解你們的產品，要上訴或提供更詳細的資料，我也非常歡迎，留言或留信都可以。
言歸正傳，上回說到NGS 最主要的突破在於改進分子操作流程，把以往需要大量人力的ＤＮＡ分離及放大步驟，利用巧妙的設計，在試管內進行，因此節省了大量的成本及時間。這個放大流程就是ＮＧＳ系統的核心競爭力，而目前市面各系統也有各自不同的放大流程及定序方法，因而各有優缺。
Roche 454 GS-FLX System
先來看看 Roche 454 GS-FLX 系統，454 life science 現在是Roche 旗下的公司，而這套系統算是商業化NGS系統的先驅。
##ReadMore##454 系統的DNA擴增原理是利用emPCR(簡介請參閱： 這裡 )，大致上是將DNA碎裂後，利用微珠去補捉單一DNA片段(註一)，再利用油去隔離微珠，因為微珠表層的親水性，在浸入油中時會包覆一親水層，這樣就可 以形成一個獨立的PCR反應器，放大的DNA片段，又為被補捉在微珠上，這樣就像以前用細菌選殖一個分段，放大成為一個又一個的"clone"，每一個微珠 可以作一個DNA片段的定序。
454的基本原理還算簡單，實際上操作還有許多提昇效率的步驟，如果你有興趣可以參考原廠的說明（這裡有非常詳細的動畫教學）。
註一：
有關為什麼一個珠子只會抓一條ＤＮＡ，我一直不太懂，我大概猜是去調整濃度，讓珠子跟ＤＮＡ相遇的機率傾向1:1 ，然後在用 enrichment 的步驟去除掉沒有抓到 DNA的珠珠吧！如果有人知道答問，可以跟我說一下嗎？
當微珠擴增完成，接下來就是定序了，一粒粒的微珠被固定在蜂窩一樣的載體上，每個孔的大下小剛好只能放一粒微珠，如此就自然的分離且固定了不同片段 的"clone"。 454是使用Pyrosequencing（註二），DNA複製酵素將一個NTP接合到DNA片段時合放出一個Pyrophosphate，這個高能量的 分子會被ATP sulfurylas 轉換為ATP ，ATP然後再被冷光酵素利用，發出冷光，系統就會偵測到有一個Base 接進ＤＮＡ了。透過流式平台，一次只供給A、T、C、G裡的一種NTP，例如GTP，當一個Clone的DNA模版片段複製位子互補的C或C x n(註三)時，酵素合成反應發生，那一格Clone就會發出亮光，如此週而復始，紀錄每一個clone每個週期的發光與否就可以反推出clone的序列。
註二：priniciple of pyrosequencing（原理示範引用自 這裡）
註三
有關如何區辨 C,CC, CCC, C..C，原理很簡單，定量就可以了，CC 發出的冷光是C的兩倍，以此類推。
在454系統中，ＤＮＡ合成為的酵素反應與自然相同，所以效率很好，所以可以做為的很長。事實上，454是目前單一片段讀取長度最長的系統，前一陣子跟他們業務聊起，據他們的說法目前己經可以念到 500bp 的長度了，這幾乎可以追上早期sanger sequencing 的長度了。
因 為454系統使用了許多微珠及蜂窩片的設計，所以一次反應能平行分析的clone數(～400000)有所限制，在總產量上比較吃虧(max: 500 x 40,000 )，而使用了這些昂貴的材料，每一次的反應成本蠻高的。這兩個因素使454系統在市場佔有率上，漸漸受到其他系統的威脅。不過，撇開成本的考量，在某些時 侯，單一定序長度有無可取代的價值，所以我個人是蠻看好他們的。
最近，Roche 出了一台迷你的 454 系統 GS junior ，實際的售價我還沒看到，但據說只有 FLX 的十分之一（不過，產量也是十分之一），如果是真的，應該是市場上一枚震撼彈，因為在某些應用上，真的不需要那麼高的定序量，例如微生物的 Genome，就算是大規模的Genome project，有少量的長片段來補Gap，在 sequence assemble 時，也會有很大的幫助，大小跟雷射印表機差不多大，一般ＰＣ就可以控制了，呵！等我中了樂透，也來買一台來玩玩！
言歸正傳，上回說到NGS 最主要的突破在於改進分子操作流程，把以往需要大量人力的ＤＮＡ分離及放大步驟，利用巧妙的設計，在試管內進行，因此節省了大量的成本及時間。這個放大流程就是ＮＧＳ系統的核心競爭力，而目前市面各系統也有各自不同的放大流程及定序方法，因而各有優缺。
Roche 454 GS-FLX System
先來看看 Roche 454 GS-FLX 系統，454 life science 現在是Roche 旗下的公司，而這套系統算是商業化NGS系統的先驅。
##ReadMore##454 系統的DNA擴增原理是利用emPCR(簡介請參閱： 這裡 )，大致上是將DNA碎裂後，利用微珠去補捉單一DNA片段(註一)，再利用油去隔離微珠，因為微珠表層的親水性，在浸入油中時會包覆一親水層，這樣就可 以形成一個獨立的PCR反應器，放大的DNA片段，又為被補捉在微珠上，這樣就像以前用細菌選殖一個分段，放大成為一個又一個的"clone"，每一個微珠 可以作一個DNA片段的定序。
454的基本原理還算簡單，實際上操作還有許多提昇效率的步驟，如果你有興趣可以參考原廠的說明（這裡有非常詳細的動畫教學）。
註一：
有關為什麼一個珠子只會抓一條ＤＮＡ，我一直不太懂，我大概猜是去調整濃度，讓珠子跟ＤＮＡ相遇的機率傾向1:1 ，然後在用 enrichment 的步驟去除掉沒有抓到 DNA的珠珠吧！如果有人知道答問，可以跟我說一下嗎？
當微珠擴增完成，接下來就是定序了，一粒粒的微珠被固定在蜂窩一樣的載體上，每個孔的大下小剛好只能放一粒微珠，如此就自然的分離且固定了不同片段 的"clone"。 454是使用Pyrosequencing（註二），DNA複製酵素將一個NTP接合到DNA片段時合放出一個Pyrophosphate，這個高能量的 分子會被ATP sulfurylas 轉換為ATP ，ATP然後再被冷光酵素利用，發出冷光，系統就會偵測到有一個Base 接進ＤＮＡ了。透過流式平台，一次只供給A、T、C、G裡的一種NTP，例如GTP，當一個Clone的DNA模版片段複製位子互補的C或C x n(註三)時，酵素合成反應發生，那一格Clone就會發出亮光，如此週而復始，紀錄每一個clone每個週期的發光與否就可以反推出clone的序列。
註二：priniciple of pyrosequencing（原理示範引用自 這裡）
註三
有關如何區辨 C,CC, CCC, C..C，原理很簡單，定量就可以了，CC 發出的冷光是C的兩倍，以此類推。
在454系統中，ＤＮＡ合成為的酵素反應與自然相同，所以效率很好，所以可以做為的很長。事實上，454是目前單一片段讀取長度最長的系統，前一陣子跟他們業務聊起，據他們的說法目前己經可以念到 500bp 的長度了，這幾乎可以追上早期sanger sequencing 的長度了。
因 為454系統使用了許多微珠及蜂窩片的設計，所以一次反應能平行分析的clone數(～400000)有所限制，在總產量上比較吃虧(max: 500 x 40,000 )，而使用了這些昂貴的材料，每一次的反應成本蠻高的。這兩個因素使454系統在市場佔有率上，漸漸受到其他系統的威脅。不過，撇開成本的考量，在某些時 侯，單一定序長度有無可取代的價值，所以我個人是蠻看好他們的。
最近，Roche 出了一台迷你的 454 系統 GS junior ，實際的售價我還沒看到，但據說只有 FLX 的十分之一（不過，產量也是十分之一），如果是真的，應該是市場上一枚震撼彈，因為在某些應用上，真的不需要那麼高的定序量，例如微生物的 Genome，就算是大規模的Genome project，有少量的長片段來補Gap，在 sequence assemble 時，也會有很大的幫助，大小跟雷射印表機差不多大，一般ＰＣ就可以控制了，呵！等我中了樂透，也來買一台來玩玩！
延伸閱讀：
一個珠子只會抓一條ＤＮＡ，這個問題我認為他有可能是利用solexa的原理來達成，也就是一顆珠子可能只會黏上一根可以bind上DNA一端的probe 其它的都是另一端可bind 放大後另一端DNA的probe 來抓住放大後的片段 這算不算抄襲 誰抄誰 也不知道
回覆刪除http://www.wellcome.ac.uk/Education-resources/Teaching-and-education/Animations/DNA/WTX056046.htm
回覆刪除第1分31秒, 有關於一個珠子只會抓一條dna
the DNA is sheared and oligonucleotide adaptors are attached. Each fragment is attached to a bead
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