之前我說過，NGS 技術要能唸到1 kb 以上才能大放大鳴！最近聽了一個演講發現那個時代近了！由NHGRI (National Human Genome Research Institute) of the NIH (National Institute of Health)資助，開發的單分子即時偵測技術（Single molecular real-time detecting， SMRT），讓NGS跨向新的境界。目前，這個項技術的機台已經由Pacific bioscience商業化了，相關的技術細節您可以從網站上看到，還有精彩的動畫可看。
來！讓我們先進一段ＶＣＲ...
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ＳＭＲＴ技術很容易理解，想像一下 ，把一顆酵素（DNA polymerase) 固定在基台上，讓他去作DNA，然後在去觀察他合成的DNA 時，吃進dNTP（標了螢光）的順序，這螢光的順序就是DNA模版的順序。說來容易，但實作上需要克服許多困難，這裡有許多聰明的工程技巧來解決，細節就不多說了，有興趣可以參看他們的說明文件。
SMRT 技術的螢光標記，跟Sanger 不同，是標在 PPi 上，所以在合成DNA時，dＮＴＰ被固定在 酵素上等著被接合，所以就可以看到酵素上有長達數微秒的螢光訊號，當dNTP 被接上DNA後，帶螢光的PPi 被切下來，螢光訊號就消失了，如果拍下連續的影像，就可以由這些訊號得到DNA 的序列。
這個定序原理有很多好處：
來！讓我們先進一段ＶＣＲ...
ＳＭＲＴ技術很容易理解，想像一下 ，把一顆酵素（DNA polymerase) 固定在基台上，讓他去作DNA，然後在去觀察他合成的DNA 時，吃進dNTP（標了螢光）的順序，這螢光的順序就是DNA模版的順序。說來容易，但實作上需要克服許多困難，這裡有許多聰明的工程技巧來解決，細節就不多說了，有興趣可以參看他們的說明文件。
SMRT 技術的螢光標記，跟Sanger 不同，是標在 PPi 上，所以在合成DNA時，dＮＴＰ被固定在 酵素上等著被接合，所以就可以看到酵素上有長達數微秒的螢光訊號，當dNTP 被接上DNA後，帶螢光的PPi 被切下來，螢光訊號就消失了，如果拍下連續的影像，就可以由這些訊號得到DNA 的序列。
這個定序原理有很多好處：
- SRMT 讀的是單分子，所以省去了DNA 放大的步驟
- 因為每一個酵素都是獨立的 detector，並不需要去同步ATCG 的NTP循環，理論上polymerase 合成DNA有多快，定序速度就能有多快！
- 螢光標在PPi 上，不會鉗入ＤＮＡ造成的構型的問題，所以Polymerase 幾近在自然狀態下運作，所以理論上Polymerase 能做多長，定序就能定多長（目前大概可作到 6~10kb，不過，酵素在雷射光下很短命，實際上，只能讀大概2 kb左右）
- 另外，因為他可以監測ＤＮＡ合成的動態狀況，所以當Template 有了變化，例如Methylation, 他有機會偵測到合成速度的差異，加以辦別！去年 nature method已經有人發表了這樣的方法。
當NGS能唸超過 1 kb 會NGS有什麼變化呢？
首先，de nove assembly 不再成為讓人痛苦的事了，2k 的序列來組 Genome 是何其快意的事，NGS不再需要 『Reads 海戰』，花20～60X 的coverage結果還組不出Genome。而且對於傳統short-read NGS分析的盲點(repeat sequence, ex, satellite DNA) ，long-read NGS 可以部份的解決這個問題，加上SMRT 還有一招 strobe mode，更是Assembly 界的大絕！
再來，RNA alternative splicing 終於有解了！過去short-read NGS 的確可以利用Exom junction 來回推 Alternatice splice 可能的形式，不過，那個是一個超複雜的多項式問題，Lucas 有曾經肖想過開發演算法，不過，後來大腦熱當功敗垂成，現 Long-read NGS 出來，一條mRNA一次（或幾次）就唸完了，好險當初沒有跳下去開發演算法！
long-read NGS 還有多的數不完的應用，我想將會引來一波新的革命，前輩們（Solid, Solexa ）要小心了，目前，SMRT 的機台已經有一些Paper 出來了，但是量產機不知什麼時候可以出貨，國內的代理也已經確定，不過，價位確定嚇死人，肯定不會比 illumina Hi-Seq 便宜，而且耗材這些開銷也很大，值不值得投資要看你口袋有多深而定了，如果想要加入 long-read NGS 的行列，但口袋很淺的朋友，別忘了還有其它的選擇，例如可以做到 800bp 的 454 系統，及未來有可能長大，唸的比較長的 ion torrent。
延伸閱讀：
Hi Lucas,
回覆刪除Ion Proton Sequencer剛出爐，有興趣可以去看看^^