新世代定序技術 (Next Generation Sequencing) 這波大浪來勢洶洶，可以預見未來幾年內整個基因體學將又有一波新革命，如果想在未來十年引領風騷，那現在就該換上泳衣跳下海逐浪了。從沙巴回來，一直想著我們跟其它國家的差距，所以想用幾篇文章跟大家簡單的分享一下NGS原理及應用，希望能拋磚引玉，引起更多 NGS 的討論。
##ReadMore##所謂, Next Generation Sequencing是很模糊的詞，因為新的定序技術眾多，但不是所有的技術都符合目前大家討論的"NGS"，我個人認為用Mass sequencing 來描述更加精確，NGS的突破來自於定序成本的大幅下降，所以我們可以使用直接定序的方法，來解決定量及定性的問題，不必再仰賴充滿干擾的雜交技術(Microarray)，有人說NGS是Microarray殺手，這是有幾分道理。
做過幾年的Array分析，其實早就發現Array的發展已經到極限，這個驅勢不難從商用晶片的發展聞到味道，在Exon及til1ng Array問市後，就再沒有更精密的的晶片的發展計劃了，而這些殺手級的晶片不但沒有大紅大紫，反而日漸凋零，最近的晶片反而越做越小，在同一片晶片中塞入更多的樣品。因為晶片的設計，限制了他的解析力，所以天生就不適合分折複雜的問題， 他們無法提供新的資訊，因為探計，僅能就已知序列作間接的測量。而且所有雜交反應，要在一個固定溫度進行，這樣的限制要做到單一鹼基的精準度，實在不是件容易的事，而生物系統本來已是無比複雜的圖形了，用Microarray來分析，隔了一層技術上的不確定性，像是霧裹看花，很難去做更精細的分析。
不過，Microarray 也有他的優勢，想對於其它技術，他是最便宜而且又可以得到全基因體資訊的技術，如果有大量樣品的分析，他是目前唯一讓人負擔的起的技術。廠商也明白這點，所以晶片才會越做越小，以符合成本降低的趨勢。
illumina 公司推出的 multiplex high-density bead microarray, 這是12x 版本,上次開會有聽說, 24-32X 的版本也正在開發,用除法來看, 以後 array 的價格可能是 現在的 1/12-32!
如果說 microarray是霧裡看花，那把基因體每一個序列都念出來，不就能得到最完整的資訊？這麼簡單的想法，為什麼沒人做？
這個想法一點也不新鮮，早在定序技術剛發明時就被提出來了，只是古代作一個基因體定序計劃，要經過冗長的手續，要建細菌 BAC Library， 養菌，挑菌，抽菌，shoot-gun， 再建 plasimd library，再養菌，挑菌，抽菌， PCR放大，純化，定序…全套作下來，動用的人力物力驚人，這樣超大型的計劃，要普及是不可能的。
一直到最近NGS的問世，這樣的構想開始從想像變得可行。NGS用人工合成的方法（容後再介紹），用微珠及叢集的技術，一個人一天就完成了過去要個把月才能完成的Library，如此省去了大量的成本及人工步驟。不過，這樣人工合成的片段，雖然快但遠較傳統PCR方式的短，所以一次分析序列也遠比Sanger法短。但成本低廉，一次實驗可以讀上千萬筆片段資料。螞蟻雄兵可以利用量的優勢達成高覆蓋頻率補足其短，再加上之前human genome project 計劃完成的基因體藍圖，解決短序列組合(contig assembly) 的問題，加上電腦技術運算能力的演進，完成了最後一塊拼圖。這些科技及知識的進步，才造就了NGS這顆明日之星。
延伸閱讀：
##ReadMore##所謂, Next Generation Sequencing是很模糊的詞，因為新的定序技術眾多，但不是所有的技術都符合目前大家討論的"NGS"，我個人認為用Mass sequencing 來描述更加精確，NGS的突破來自於定序成本的大幅下降，所以我們可以使用直接定序的方法，來解決定量及定性的問題，不必再仰賴充滿干擾的雜交技術(Microarray)，有人說NGS是Microarray殺手，這是有幾分道理。
做過幾年的Array分析，其實早就發現Array的發展已經到極限，這個驅勢不難從商用晶片的發展聞到味道，在Exon及til1ng Array問市後，就再沒有更精密的的晶片的發展計劃了，而這些殺手級的晶片不但沒有大紅大紫，反而日漸凋零，最近的晶片反而越做越小，在同一片晶片中塞入更多的樣品。因為晶片的設計，限制了他的解析力，所以天生就不適合分折複雜的問題， 他們無法提供新的資訊，因為探計，僅能就已知序列作間接的測量。而且所有雜交反應，要在一個固定溫度進行，這樣的限制要做到單一鹼基的精準度，實在不是件容易的事，而生物系統本來已是無比複雜的圖形了，用Microarray來分析，隔了一層技術上的不確定性，像是霧裹看花，很難去做更精細的分析。
不過，Microarray 也有他的優勢，想對於其它技術，他是最便宜而且又可以得到全基因體資訊的技術，如果有大量樣品的分析，他是目前唯一讓人負擔的起的技術。廠商也明白這點，所以晶片才會越做越小，以符合成本降低的趨勢。
illumina 公司推出的 multiplex high-density bead microarray, 這是12x 版本,上次開會有聽說, 24-32X 的版本也正在開發,用除法來看, 以後 array 的價格可能是 現在的 1/12-32!
如果說 microarray是霧裡看花，那把基因體每一個序列都念出來，不就能得到最完整的資訊？這麼簡單的想法，為什麼沒人做？
這個想法一點也不新鮮，早在定序技術剛發明時就被提出來了，只是古代作一個基因體定序計劃，要經過冗長的手續，要建細菌 BAC Library， 養菌，挑菌，抽菌，shoot-gun， 再建 plasimd library，再養菌，挑菌，抽菌， PCR放大，純化，定序…全套作下來，動用的人力物力驚人，這樣超大型的計劃，要普及是不可能的。
一直到最近NGS的問世，這樣的構想開始從想像變得可行。NGS用人工合成的方法（容後再介紹），用微珠及叢集的技術，一個人一天就完成了過去要個把月才能完成的Library，如此省去了大量的成本及人工步驟。不過，這樣人工合成的片段，雖然快但遠較傳統PCR方式的短，所以一次分析序列也遠比Sanger法短。但成本低廉，一次實驗可以讀上千萬筆片段資料。螞蟻雄兵可以利用量的優勢達成高覆蓋頻率補足其短，再加上之前human genome project 計劃完成的基因體藍圖，解決短序列組合(contig assembly) 的問題，加上電腦技術運算能力的演進，完成了最後一塊拼圖。這些科技及知識的進步，才造就了NGS這顆明日之星。
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文章写的很好，我不是做基因组学的，但是最近在研究next-generation squencing,给了我很大的帮助，谢谢啊。还有没有后续的文章了呢？
回覆刪除最近開始接觸RNA-seq, 你的文章幫我很多, 謝謝~
回覆刪除板主回覆：
回覆刪除謝謝你！最近太多人來追殺進度，所以一直沒有機會好好的坐下來寫續集，等月底兩個重要專案結案，就可以排入第一案，呵！讓大家等太久了，失禮啦！